Nekroptoza

[pixabay]_(https://pixabay.com/en/dna-microscopic-cell-gene-helix-1903318/)

        Ćelijska smrt ima važnu ulogu u mnogobrojnim procesima, uključujući modeliranje tkiva tokom embriogeneze, razvoju imunog sistema i uklanjanju oštećenih ćelija. Previše ili premalo ćelijske smrti podupire različite patologije, poput kancera, autoimuniteta, neurodegeneracije i povreda. Uopšteno, načini na koje se odigrava ćelijska smrt mogu se podeliti na neregulisanu, koja se javlja kao posledica mehaničkog oštećenja ili toksičnih agenasa, i regulisanu, gde sama ćelija doprinosi sopstvenoj smrti.  

         Poslednjih godina shvatanja o regulaciji ćelijske smrti su se promenila. Danas ne samo apoptoza već i neki oblici nekroze se smatraju regulisanim, kao što je nekroptoza. Pre oko 50 godina, proces regulisane ćelijske smrti je opisan i nazvan apoptoza. Nekroza je smatrana za neregulisani i neprogramirani put ćelijske smrti. Od tih ranih shvatanja mnogobrojni novi koncepti ćelijkse smrti su otkriveni i opisani. Kad god je ćelijska smrt regulisana i javlja se kao deo održavanja tkivne homeostaze, takva smrt se definiše i imenuje kao „programirana“. Tokom poslednje dekade otkriven je veliki broj novih oblika ćelijske smrti i veliki broj in vivo i in vitro studija su okarakterisale nove forme regulisane ćelijske smrti, izuzev apoptoze, sa asociranim regulatornim signalnim putevima. Ove studije su utemeljile put daleko širem shvatanju alternativnih puteva ćelijske smrti i njihovih posledica na fiziologiju i patofiziologiju. Jedan od novo opisanih regulisanih puteva ćelijske smrti jeste nekroptoza . U ovom radu će biti reči o tome šta je zapravo nekroptoza, kako dolazi do njene inicijacije i egzekucije kao i o njenoj funkciji i posledicama.  

  ŠTA JE TO NEKROPTOZA I KAKO SE ODIGRAVA.  

[peakpx]_(http://www.peakpx.com/586386/brown-and-green-microorganism)

         Dugo godina nekroza je smatrana nekontrolisanom formom slučajne ćelijske smrti. Pretpostavljalo se da se javlja kad je ćelija toliko oštećena da vise ne može da se obnovi. Međutim, otkriveno je da različiti tipovi ćelijske smrti, koje morfološki nalikuju nekrozi, su kontrolisane različitim i distinktnim signalnim putevima.  

         Nekroptoza je opisana kao opšti neapoptotski put ćelijske smrti, indukovane različitim ekstracelularnim stimulusima, od kojih je prvi faktor nekroze tumora TNF (engl. Tumor Necrosis Factor). Nekroptoza se najupadljivije uočava kada je intracelularni signal za apoptozu inhibiran. Prvobitno je definisana kao ćelijska smrt koju karakteriše morfološka sličnost sa nekrozom, istovremena aktivacija autofagije i zavisnost od funkcije RIPK1 (engl. Receptor-Interecting Serine/Threonine-Protein Kinase 1). Kasnije mehanizam nekroptoze je detaljnije definisan: nekoliko grupa je zapazilo da , tokom nekroptoze, RIPK1 aktivira RIPK3 (engl. Receptor-Interecting Serine/Threonine-Protein Kinase 3) i da on formira kompleks koji može al i ne mora da sadrži RIPK1**. Prema tome, RIPK3 aktiviran od strane RIPK1 dobija sposobnost da fosforiliše i aktivira MLKL (engl. Mixed Lineage Kinase Domain-Like Protein). Srž molekularnog kompleksa RIPK1 i RIPK3 se naziva nekrozom 

  Česti izazivači nekroptoze  

         Nekroptoza je najviše proučavana na stimulaciji receptora smrti (DR – engl. Death Receptor). TNF receptor (TNFR) je sprecifičan receptor smrti za nekroptozu, međutim nova istraživanja su povezala i CD95 i TRAIL-R1/R2 kao induktore nekroptoze. Receptori smrti dele sličnosti u njihovoj proteinskoj strukturi: sadrže ekstracelularni N-kraj cistein bogatih domena, kojis u odgovorni za selektivnost prema ligandu, i citoplazmatski domen smrti koji je neophodan deo signalnog puta. Tokom godina, ekstenzivni eksperimentalni dokazi su pokazali da različiti tipovi ćelija mogu biti senzitizovana na DR- indukovanu nekroptozu inhibicijom kaspaze pomoću farmakoloških jedinjenja poput zVAD-fmk. Primer ovakve biološke reakcije ćelije je mišija ćelija L929, koja prolazi krot spontanu ili TNF-indukovanu nekroptozu kad god se ćelija tretira nekim inhibitorom kaspaze. Kasnija istraživanja su pokazala da barem deo nekroptotskog odgovora je posredovano autokrinom sekrecijom TNF-a. Korišćenjem antagoniste** apoptotskog inhibitornog proteina IAP (engl. Inhibitor of Apoptosis Protein) pokazano je da veliki broj tipova ćelija prolati kroz nekroptozu usled stimulacije DR-a, ako su IAP ili kaspaze blokirane ili odsutne: npr. Keratinocite usled stimulacije CD95L; ćelije akutne mijeloidne leukemije; makrofagi kada se tretiraju TNF-om. Neka istraživanja su ukazala na mogućnost intercelularne modulacije apoptotičke naspram nekroptotičke ćelijske smrti, pošto je pokazano da TRAIL indukuje nekroptozu pri kiselim vrednostima pH preko RIPK1-RIPK3 signalnog puta, gde je PARP (engl. Poly ADP-Ribose Polymerase) aktivni daunstrim** efektor. Različiti ćelijski stimulusi izazivaju aktivaciju nuklearnog faktora-kB (NF-kB). NF-kB aktivnost, pod normalnim okolnostima, dovodi do produkcije i sekrecije TNF-a omogućujući autokrinu TNFR stimulaciju.Toll-like receptori (TLR) su kljucni senzori urođenog imunog sistema da prepozna DAMP (engl. Damage-Associated Mollecular Pattern) i aktivira inflamatornu signalizaciju. Inhibicijom kaspaze-8 tokom stimulacije TLR2 (engl. Toll-Like Receptor 2), TLR2, TLR3, TLR4, TLR5 i TLR9 podstiče RIPK3/MLKL-zavisnu nekroptozu, koja se javlja preko adaptornog molekula TRIF ili MyD88 kod makrofaga i drugih tipova ćelija. TLR3 i TLR4 direktno indukuju RIPK3-zavisnu nekroptozu preko MLKL. 

          Mišiji citalomegalovirus MCMV (engl. Mouse CytaloMegaloVirus) može da aktivira molekul koj sadrži RHIM, DNK-zavisan aktivator interferonskog regulatornog faktora (DAI) i izazvati RIPK3-zavisnu nekroptozu. DAI aktivira nekroptotsku signalnu kaskdau direktno preko RIPK3, bez učešća RIPK1, verovatno preko homotipske interakcije DAI RHIM sa RHIM iz RIPK3. Ne samo što stimulacije receptora i virusne infekcije indukuju nekroptozu, nego i brojni unutraćelijski stimulusi, poput genotoksicnog stresa indukovanog etopozidom, indukuju nekroptozu downregulation** IPA. Ovo dovodi do indukcije nekroptoze nezavisne od  TNF,TRAIL i CD95L signalizacije  

         Nekoliko signalnih puteva (TLR3, CD95, etopozid, itd.) su pokazali da zahtevaju formiranje velikog molekularnog kompleksa kako bi izvršili nekroptozu; taj molekularni kompleks je nazvan riptozom zato što sadrži veliku količinu RIPK1. Do sad poznate komponente ovog kompleksa su RIPK1, kaspaza-8, Fass-associated DD (FADD) I ćelijski FLICE-inhibitorni protein cFLIP (engl. cellular FLICE-Inhibitory Protein). Ukoliko cFLIP nije prisutan kaspaza-10 je komponenta koja ga menja, sa još do sad nepoznatom funkcijom. Name-giving kinaza RIPK1 je centralna komponenta riptozoma.  

  Izvršavanje nekroptoze   

        Prateći prvobitnu aktivaciju, RIPK1-RIPK3 kompleks propagira feed-forward** mehanizam koji dovodi do formacije velike filamentozne strukture koja deli biofizičke sličnosti sa β-amiloidom. Stvaranje ovih amiloidnih struktura zavisi od interakcije RHIM-domena ova dva proteina. Važno je istaći da istovremeno povećavanje RIPK3 aktivnosti dovodi do započinjanja nekroptoze propagirane ovim amiloidnim strukturama. Ostaje nejasno da li se slične amiloidne strukture formiraju kod nekroptoze izazvane nekim drugim stimulusom, kao što je TLR. Štaviše, uzimajući u vid stabilnost ovih proteinskih struktura, one mogu doprinositi ćelijskoj toksičnosti čak i u odsustvu RIPK3 aktivnosti.  

        Pitanje kako se nekroptoza izvršava je idalje kontraverzno. Različita istraživanja su predložila ulogu ROS (engl. Reactive Oxygen Species) ili nagle potrošnje ćelijskog ATP u egzekuciji nekroptoze. To implicira da je mitohondrijska disfunkcija ključni događaj u izvršavanju nekroptoze. Ovu ideju podržava to što prateći njegovu formaciju, nekrozom koji sadrži RIPK3 i MLKL je uočen kako trenslocira membranu endoplazminog retikuluma asociranog sa mitohondrijom, mada je idalje nejasno da li je ta translokacija neophodna za smrt. Dva mitohondrijska proteina PGAM5 (mitohondrijska fosfataza) i Drp-1 ( protein neophodan ya mitohondrijsku fisiju) su predložene kao komponente downstream signalizacije nekrozoma. Prateći RIPK3 zavisnu fosforilaciju, kratka izoforma PGAM5 (PGAM5s) aktivira Drp-1, što dovodi do ekstenzivne mitohondrijske fisije, ROS produkcije i nekroptoze. Međutim, uloga ROS u nekroptozi ostaje nejasna. Skorašnje studije su istraživale ulogu mitohondrija u nekroptozi generišući ćelije sa manjkom mitohondrija. Za efikasno pražnjenje mitohondrija korišćena je Parkin-posredovana mitofagija. Iako pražnjenje mitohondrija utiče na nekroptotski asociran ROS, ona nema nikakvog uticaja na kinetiku i opseg nekroptoze indukovane od strane TNF ili aktivacije RIPK3. Ovo sa jasno suočava sa mišljenjem da su mitohondrije ključni efektori u izvršavanju nekroptoze. Skorašnja istraživanja su otkrila da MLKL može da permeabiliše membranu, što podržava mišljenje o mitohondrijski nezavisnoj mašineriji. Prateći RIPK3 posredovanu fosforilaciju, MLKL se oligomerizuje i translocira do plazma membrane gde dovodi do njenog raspada. Kako MLKL permeabiliše membranu nije još sasvim jasno, ali ovaj porces možda zahteva funkcionalnu interakciju sa katjonskim aknalom (poput TRMP7) koji dozvoljavaju priliv katjona. Preostalo kljucno pitanje je da li je generalni mehanizam nekroptotske egzekucije konzerviran između rezličitih tipova ćelija i/ili praćen različitim stimulusima. Povrh toga, iako nekroptotski asociran ROS možda nije neophodan za nekroptozu, ostaje ne istrženo pitanje da li on utiče na to kako imuni sistem reaguje na nekroptotsku ćeliju. 

  FUNKCIJE I POSLEDICE NEKROPTOZE  

        Nekroptoza igra važnu ulogu u zaštiti od virusa. Neki virusi poput MCMV, virsu zapadnog nila, herpes simpleks virus, HIV-1 indukuju RIPK3 zavisnu nekroptozu. Imajući to u vidu nije začuđujuće to što su neki virusi razvili antinekroptotičke regulatore. Moguće je da je nekroptoza nastala kao rezervni mehanizam domaćina da izazove smrt ćelije zaražene virusom. Alternativno, nekroptoza indokovana virusom možda pomaže virusu da ugasi domaćinov inflamatorni odgovor. 

       Pokazano je da nekroptoza, u imunom sistemu, reguliše broj T-ćelija u perifernom tkivu tokom njihovog razvoja. Istraživanja u RIPK3/kaspaza-8 i RIPK3/FADD double-knouckout** miševima su pokazala da je RIPK3-posredovana nekroptoza neophodna za uklanjanje abnorlmanih limfocita tokom razvoja. Dodatno, miševi koji imaju manjak kaspaze-8 ili funkcionalne FADD u T ćelijama ne mogu da formiraju imunski odgovor na infekciju virusom murinskog hepatitisa. Aktivnost imunološkog sistema se vraća u normalu kada dođe do manjka RIPK3.

          Efekti nekroptotske ćelijske smrti u tkivnim inflamacijama se trenutno izučavaju. Primer potencijalne proinflamatorne uloge nekroptoze je Kronova bolest, neizlečivo zapaljenjsko oboljenje creva čoveka. Snažna RIPK3 ekspresija i nekrotička morfologija ćelijske smrti u zahvaćenom tkivu sugeriše da nekroptoza ima veliku ulogu u razvoju ove bolesti. Korišćenjem mišijih modela, conditional knockout** kaspaze-8 u crevu dovela je do spontanog razvoja ove bolesti.  

        Nekroptoza možda ima i važnu ulogu u transplataciji organa. Korišćenjem mišijeg modela, RIPK3-posredovana nekroptoza u donorskom bubregu može da dovede do inflamatornih rana, i ima veliki uticaj na bubrežni IRI i opstanak transplanta. Moguće je da inhibicijom nekroptoze u donorskom organu, može omogućiti ne tako intenzivnan imunosupresorski režim** u budućnosti, kada bude bila moguća ciljana inhibicija nekroptoze.   

Zaključak 

        Iako je znaje o nekroptozi prethodnih godina znatno veće, idalje ostaju neka pitanja na koje treba dati odgovor. Kako se nekroptoza odigrava, da li postoji kaskadna putanja ili postoje ralike izmedju ćelijskih, odnosno stimulusnih tipova? Kada se nekroptoza javlja in vivo i koje se njene uloge? Da li se nekroptoza javlja kada aktivnost kaspaze nije inhibirana? Da li može da se razvije metod kojim će se nekroptoza detektovati in vivo? To su samo neka od pitanja na koja još nepostoji jasan odgovor. Potrebno je još dosta rada kako bi se razumela molekularna platforma po kojoj funkcioniše nekroptoza. Boljim shvatanjem ovog procesa moguće je otkriti kako i zašto dolazi do određenih oboljenja i na kraju kako se ta oboljenja mogu izlečiti.  

Zahvalio bih se kolegi Petru Omrčenu, mladom naučniku u povoju, koji je odgovoran za ovaj rad o nekroptozi. Pred njim je blistava karijera, i ovim putem želim da pokažem da verujem u njega, i od njega očekujem barem jednu Nobelovu nagradu. Slike sam pronasao na Pixabay.

Literatura: http://jcs.biologists.org/content/127/10/2135 http://onlinelibrary.wiley.com/doi/10.1111/febs.13120/pdf